超分辨STED顯微鏡通過受激發(fā)射損耗機(jī)制突破光學(xué)衍射極限，實(shí)現(xiàn)納米級(jí)分辨率成像。本文結(jié)合實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)，系統(tǒng)梳理從樣品制備到圖像優(yōu)化的全流程技巧，助力研究者高效獲取高質(zhì)量超分辨數(shù)據(jù)。

一、樣品制備的精細(xì)化控制

熒光標(biāo)記策略

選擇與STED損耗光波長匹配的染料：592nm損耗光適用mTFP1、eGFP等；660nm損耗光適用DsRed、Alexa Fluor 546等。避免使用DAPI/Hoechst等核染料以減少背景干擾。

優(yōu)化標(biāo)記密度：建議使用2-5倍常規(guī)濃度抗體，確保超分辨成像所需的熒光信號(hào)強(qiáng)度。

封片劑與樣品厚度

樣品厚度需控制在20μm內(nèi)，封片劑推薦使用ProlongGold或Mowiol，折射率需接近1.518且不被損耗光激發(fā)。

避免使用Vectashield、DABCO/NPG等封片劑，防止激發(fā)背景熒光。

二、激光參數(shù)的動(dòng)態(tài)優(yōu)化策略

波長與功率匹配

激發(fā)光波長需接近熒光染料吸收峰，損耗光波長應(yīng)位于熒光發(fā)射光譜尾部。例如，Atto 647N染料適配640nm激發(fā)光與775nm損耗光。

連續(xù)型STED建議從低功率（如50mW）開始逐步增加，脈沖型需控制脈沖寬度（<1ns）與重復(fù)頻率（80MHz）。

時(shí)間門控與數(shù)字增強(qiáng)

啟用時(shí)間門控探測(cè)（G-STED）或數(shù)字增強(qiáng)型STED，可降低損耗光需求，提升信噪比。例如，在1.3mW損耗光功率下實(shí)現(xiàn)90nm橫向分辨率。

三、光學(xué)系統(tǒng)的關(guān)鍵配置

物鏡與光斑生成

B須使用專用物鏡（如100× STED物鏡），確保激發(fā)光與損耗光空間重合。

環(huán)形光斑生成推薦渦旋相位板（固定波長）或空間光調(diào)制器（多波長可編程）。

校準(zhǔn)與像差校正

每次開機(jī)需執(zhí)行自動(dòng)校準(zhǔn)流程（Alignment），確保光束對(duì)齊。

結(jié)合自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)校正像差，提升厚樣品成像質(zhì)量。

四、環(huán)境干擾的主動(dòng)抑制

溫濕度與振動(dòng)控制

溫度穩(wěn)定在20±2℃，濕度<60%，配備主動(dòng)式防震臺(tái)（抑制振動(dòng)至0.1μm以下）與電磁屏蔽罩。

活細(xì)胞成像需集成恒溫培養(yǎng)室（37℃±0.1℃、5% CO?）與光片照明模塊，減少光毒性。

空氣潔凈度管理

使用HEPA過濾器維持ISO 5級(jí)潔凈度，避免灰塵顆粒散射光線。

五、圖像采集與后期處理技巧

多通道成像策略

采用順序掃描（Sequential Scan），避免熒光串色。檢測(cè)波長范圍需覆蓋熒光素發(fā)射峰并避開STED光波長。

啟用幀平均（4-8幀）或單分子定位（定位STED）提升分辨率。

噪聲抑制與三維重構(gòu)

應(yīng)用中值濾波去除椒鹽噪聲，結(jié)合去卷積算法（如Richardson-Lucy）優(yōu)化分辨率。

三維成像推薦isoSTED架構(gòu)，結(jié)合自適應(yīng)光學(xué)校正軸向像差，實(shí)現(xiàn)各向同性分辨率（如50nm×50nm×50nm）。

六、常見問題的預(yù)防性處理

光漂白與光毒性控制

使用低功率損耗光、光片照明或抗氧化緩沖液（如OxyFluor）。

避免長時(shí)間激發(fā)，采用快門控制減少非必要曝光。

污染與漂移處理

每日清潔物鏡與載物臺(tái)，定期更換浸液（如油鏡需專用鏡油）。

啟用實(shí)時(shí)反饋系統(tǒng)（壓電陶瓷掃描臺(tái)）與標(biāo)記物追蹤算法，糾正樣品漂移。

掌握STED顯微鏡的操作核心在于理解熒光損耗機(jī)制與光學(xué)系統(tǒng)的協(xié)同優(yōu)化。